Лигандообменная хроматография

Для сокращения времени анализа, повышения его чувствительности и точности требуется повышение эффективности колонки, что достигается за счет уменьшения частиц полистирольного сорбента. Перспективным является получение сорбентов для лигандообменной хроматографии на основе пористых силикагелей, химически модифицированных активными лигандами. Поверхность силикагеля связывается через n-пропиленовые мостики с L-оксипролиновыми лигандами.

В настоящее время создано и испытано около десятка асимметрических силикагелевых сорбентов. Хотя в большинстве сорбентов использованы оптические изомеры пролина и оксипролина, они различаются сродством к различным аминокислотам и порядком их элюирования; это связано с тем, что подвижный лиганд фиксируется в комплексе не только координацией карбоксильной и аминогруппой с ионом меди, но и взаимодействием бокового радикала аминокислоты с ближайшим окружением координационного центра, что определяет в конечном итоге порядок удерживания антиподов аминокислот сорбенте.

Поскольку сорбенты для лигандообменной хроматографии выпускаются, предложены некоторые модификации метода, позволяющие использовать традиционные сорбенты. Так, N-алкилированные оптически активные аминокислоты сорбируются на обращенно-фазном силикагеле. В алкильном радикале должно быть больше 5–6 углеродных атомов. В этом случае модификатор прочно удерживается на сорбенте и не смывается водным элюентом, в который добавляют следовые количества меди.

Определение микропримесей

ВЭЖХ является надежным методом анализа микропримесей–веществ с концентрацией 0,01%.

В жидкостной хроматографии применяют селективные детекторы (амперометрический, флуориметрический и др.), способные детектировать очень малое количество вещества. Очистка образца до ввода в жидкостной хроматограф минимальна, нередко его вводят без предварительной обработки, и без получения производных, что часто невозможно при применении других методов анализа. Наконец, в жидкостной хроматографии возможно создание уникального диапазона селективных взаимодействий за счет изменения подвижной фазы, что значительно улучшает разрешающую способность всей хроматографической системы. Работа с микропримесями налагает ряд требований на весь процесс разделения. Особенное значение имеет разрешающая способность колонки, выбор детектора, предварительная обработка образца и построение калибровочного графика. Правильный выбор условий хроматографирования позволяет повысить чувствительность, надежность и воспроизводимость результатов, что очень актуально при работе с микропримесями.

Предварительная подготовка образца и его ввод в хроматограф

Перед анализом микропримесей для повышения чувствительности желательно провести концентрирование соединения методами, описанными в соответствующем разделе. Предпочтительно применять оборудование, позволяющее проводить автоматическую предварительную обработку образца, в том числе экстрагирование, измельчение, фильтрацию и автоматический ввод в хроматограф.

Для получения высокой чувствительности нужно вводить максимально возможный объем образца. При работе в изократическом режиме на высокоэффективных аналитических колонках оптимальный объем образца составляет от 100 до 500 мкл. Ввод большого объема разбавленного образца позволяет компенсировать относительно низкую чувствительность некоторых детекторов для жидкостной хроматографии.

При небольших количествах образца анализ проводят на колонках с внутренним диаметром 1–2 мм, что уменьшает его расход. Используя в качестве растворителя пробы слабый растворитель, можно наносить на колонку большие объемы образца. При этом он накапливается на входе в колонку, так как к' для компонентов образца велико и в колонке происходит концентрирование микропримесей, что значительно повышает чувствительность обнаружения. Пользуясь этим приемом, можно обнаружить некоторые малополярные органические соединения, например ароматические углеводороды, присутствующие в виде микропримесей в сточных водах, на колонке с обращенной фазой.

Для обеспечения наибольшего концентрирования растворитель пробы должен быть по возможности слабым, например, содержать 90–95% воды. В дальнейшем для элюирования пробы силу подвижной фазы резко увеличивают. Концентрирование на колонке позволяет в некоторых случаях вводить 1 л и более образца при конечном объеме зоны интересующего нас вещества менее 50 мкл (градиентное элюирование), т.е. концентрировать вещество в 20 000 раз. Можно повысить чувствительность обнаружения, проводя концентрирование образца и вне колонки, например, выпаривая растворитель. Однако надо быть уверенным, что при этом не происходит потеря или видоизменение примесей. Кроме того, при таком процессе значительно повысится содержание основных компонентов в образце, что приведет к перегрузке по ним колонки и затруднит анализ. Вещества, удерживаемые сильнее, чем примеси, могут быть после анализа, удалены из колонки не только за счет повышения силы растворителя, но и путем обратной промывки колонки.