Анализ биоматериалов с помощью ЯМР

Метод ЯМР позволяет обнаруживать и одновременно количественно определять в биологических жидкостях тысячи компонентов, в том числе метаболиты и биомаркеры, и тем самым проводить достаточно полную диагностику организма, обнаруживать на ранних стадиях различные патологии, в том числе генетически обусловленные заболевания, формировать группы риска пациентов, предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям, отслеживать реакции организма на воздействие патогенов, токсических веществ и лекарственных препаратов в динамике.

Основным преимуществом ЯМР является минимальная пробоподготовка. Кроме того, метод позволяет многократно использовать одну и ту же пробу.

Основной недостаток – по чувствительности этот метод уступает хромато-масс-спектрометрии и методам оптической спектрометрии. Но он устраняется с помощью наполнения спектра – суммирование результатов увеличивает соотношение сигнал\шум пропорционально корню квадратному из числа измерений.

Помимо ЯМР 1Н все шире используется ЯМР 13С, а также ЯМР 31Р. Но, из-за небольшой концентрации этих изотопов в организме, применение этих методов ограничено.

При количественном анализе спектра возникают определенные трудности вследствие перекрывания резонансных сигналов различных соединений. Но обычно один и тот же компонент дает сигнал в различных областях, поэтому почти всегда удается найти такую область, в которой один из сигналов достаточно хорошо отделен и пригоден для интегрирования.

Особая сложность количественного анализа биологических жидкостей и тканей, которые могут содержать сотни компонентов в очень большом интервале концентраций, в том, что обычно заранее не известно, до какой глубины необходимо проводить анализ и каким минимальным уровнем содержания компонентов следует ограничиться.

При исследовании тканей методом ЯМР их используют как в нативном, так и в экстрагированном состоянии. Но отбор биожидкостей проще осуществить, поэтому они используются чаще.

При анализе спектров любых биоматериалов возникает ряд общих проблем, решение которых требует специальных методов.

1. Подавление сигнала воды

Вода – это основа любой биожидкости. Ее сигналы всегда интенсивнее сигналов растворенных веществ. Для подавления сигнала воды можно использовать лиофилизацию, а затем растворить осадок в D2O. Но во время лиофилизации теряются летучие и нестабильные компоненты. Вследствие этого анализ теряет точность.

Чаще для подавления сигнала воды используют специальные импульсные последовательности. Одна из них – метод селективного предварительного насыщения. – на пробу воздействуют радиочастотными импульсами большой длительности, селективно настроенными на частоту сигнала воды. Разработаны и более сложные последовательности.

2. Пробоподготовка

К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D2O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3-2Н4]-пропионат натрия.

На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений.

Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.

Для большинства измерений используют частоту ЯМР 500-700 МГц.

3. Методы обработки и интерпретации спектров

Спектр ЯМР любой биологической жидкости – это суперпозиция спектров огромного числа соединений, среди которых лишь несколько десятков представляют реальный интерес, так как только их присутствие или изменение и концентрации несет информацию, важную с точки зрения медицинской диагностики.

Полный анализ занимает много времени, не целесообразен, так как не выполняет основную задачу – быстро обнаружить аномалию и определить ее природу.

Для анализа спектров используется подход, основанный на сверке информации. Сначала отбирают группу «здоровых» людей (от нескольких десятков до нескольких сотен человек) и измеряют спектры взятых у них биологических жидкостей в строго стандартных условиях. Затем каждый спектр преобразуют в гистограмму. При этом количество данных значительно сокращается без существенной потери информации. Затем интегральные интенсивности сводят из гистограммы в таблицу по спектрам для всех измеренных образцов. Полученную матрицу данных обрабатывают с помощью стандартных методов статистического анализа. При анализе биологических жидкостей пациента достаточно определить, вписывается ли значение интенсивностей в средние показатели для здоровых людей.